Bệnh lở mồm long móng là một loại bệnh truyền nhiễm rất nguy hiểm do virus gây ra trên động vật móng guốc chẵn như lợn, bò, trâu, hươu, dê... Bệnh lây lan nhanh và mạnh, làm nhiều gia súc nhiễm bệnh và nhanh chóng bùng phát thành dịch. Trung bình cứ 2 - 3 năm, ở Việt Nam lại xuất hiện một đợt dịch lở mồm long móng, gây thiệt hại lớn về kinh tế của người chăn nuôi và ngân sách nhà nước.
“Tác nhân gây bệnh lở mồm long móng là loại Picornavirut nhỏ thuộc họ Picornavirut, không vỏ với 7 type huyết thanh. Trong số đó, type huyết thanh O, A và Asia1 là type đặc hữu cho các nước Đông Nam Á.” - TS Lê Thị Hồng Minh (Viện Hóa sinh biển, Viện hàn lâm KH&CN Việt Nam) cho biết trong bản mô tả giải pháp hữu ích về quy trình tạo hạt giả virus gây bệnh lở mồm long móng để sản xuất vacxin được Cục Sở hữu trí tuệ cấp vào năm 2019.
Virus gây bệnh lở mồm long móng có khả năng biến chủng cao, do đó vacxin phòng bệnh lở mồm long móng chỉ có tác dụng phòng bệnh hiệu quả khi chủng virus được dùng để sản xuất vacxin là chủng virus có tương đồng kháng nguyên với chủng gây bệnh ngoài thực địa. Nói cách khác, chủng virus dùng để sản xuất vacxin nên được phân lập ở các vùng phát dịch. “Mặc dù Việt Nam đã triển khai rộng rãi chiến lược phòng chống dịch bệnh lở mồm long móng bằng vacxin đơn giá và đa giá ngoại nhập, nhưng hiệu quả phòng bệnh chưa cao, dịch bệnh vẫn thường xuyên xảy ra” – nhóm nghiên cứu cho biết.
Minh họa cấu trúc của hạt virus tự nhiên (trái) và hạt giả virus (phải). Ảnh: dovepress
Điều này cho thấy có thể có một sự sai khác đáng kể về đặc tính kháng nguyên của chủng virus lở mồm long móng gây bệnh ở ‘ổ dịch’ với chủng virus vacxin ngoại nhập. Sự sai khác này sẽ dẫn đến kháng thể kháng virus có trong động vật được tiêm phòng không thể bảo vệ được chúng khỏi các chủng virus ngoài thực địa. Mặc dù tiêu chí nhập khẩu vacxin lở mồm long móng tại Việt Nam theo thông báo của Cục Thú y có căn cứ vào kết quả đánh giá mức độ tương đồng kháng nguyên, tuy nhiên số lượng nhập khẩu vẫn rất hạn chế, không đủ để đáp ứng nhu cầu của các địa phương.
Thêm vào đó, bên cạnh sự khác biệt về đặc tính kháng nguyên của chủng virus, một vấn đề gây ‘đau đầu’ khác cho các nhà khoa học chính là việc một số quy trình sản xuất vacxin để phòng ngừa virus lở mồm long móng trên thế giới - như vacxin virus sống, vacxin virus bất hoạt, vacxin dưới đơn vị/tái tổ hợp,…, đều bộc lộ một số nhược điểm khác nhau liên quan đến vấn đề an toàn sinh học, không đáp ứng miễn dịch rộng và lâu dài, đột biến ngẫu nhiên, sắp xếp lại tự phát, và đặc biệt có thể lây nhiễm bệnh cho vật chủ.
Trước thực trạng này, vào năm 2015, TS Lê Thị Hồng Minh (Viện Hóa sinh biển, Viện hàn lâm KH&CN Việt Nam) cùng các đồng sự đã cùng nhau tìm kiếm một phương án tối ưu, góp phần giải quyết vấn đề thiếu hụt nguồn cung vacxin như hiện nay. Theo đó, nhóm nhận thấy hướng nghiên cứu tạo các hạt giả virus (Virus like particle - VLP) đang được xem là một bước đột phá trong công nghệ sản xuất vacxin thế hệ mới. “VLP được tạo ra bởi các protein cấu trúc của virus, có cấu trúc tương tự như các hạt virus tự nhiên nhưng không mang vật liệu di truyền của virus, do đó không có khả năng lây nhiễm. Nhờ có cấu trúc tương tự virus tự nhiên bao gồm các protein kháng nguyên quan trọng của virus, VLP sẽ được hệ thống miễn dịch phòng vệ của vật chủ nhận biết và tạo đáp ứng miễn dịch phòng vệ cao tương tự như khi động vật bị nhiễm virus tự nhiên.” – nhóm nghiên cứu cho biết.
Hướng nghiên cứu này có thể xem là phương án “một mũi tên trúng hai đích” - không chỉ giúp tạo được kháng nguyên virus type O, đặc trưng cho các chủng virus Picornaviridae gây bệnh lở mồm long móng cho động vật phổ biến ở Việt Nam, mà còn giúp phát triển được một loại vacxin an toàn, hiệu quả, không mắc phải những nhược điểm như những loại vacxin trước.
Kích thích hệ miễn dịch
Theo nhóm nghiên cứu, để tạo hạt giả virus gây bệnh lở mồm long móng, trước tiên cần phân lập cADN của gene mã hóa VP0 và VP1-2A-VP3. “Để tách chiết ARN tổng số của virus gây bệnh từ mẫu sinh phẩm bằng cách lấy 200µl mẫu, bổ sung 600µl dung dịch phản ứng TriZol vào mẫu. Sau khi trộn đều, tiếp tục bổ sung 200µl chloroform, trộn đều thêm lần nữa và ly tâm 1200xg trong 10 phút ở 4oC, thu phần dịch nổi, bổ sung isopropanol theo tỷ lệ 1:1 và ly tâm ở 12000xg trong 10 phút, thu cặn và rửa bằng etanol 70% rồi ly tâm tiếp ở 7200 vòng/phút trong 10 phút để thu được ARN tổng số” – nhóm nghiên cứu mô tả.
Sau đó, cần phiên mã ngược để thu cADN bằng cách bổ sung ARN tổng số với mồi oligo (dT). Sau khi biến tính ARN trong 5 phút, nhóm bổ sung đệm dNTP và ủ ở 27oC trong 50 phút, tiếp đó bổ sung enzyme phiên mã ngược M-MLV để tổng hợp thu được cADN mạch đơn.
Bước hai, các nhà khoa học khuếch đại đoạn gen VP0 và VP1-2A-VP3 bằng cách tiếp hành PCR với cặp mồi và cADN thu được trước đó. Sau khi khuếch đại đoạn gen, nhóm tiếp tục tối ưu hóa đoạn gen bằng cách gắn bổ sung các đoạn mã hóa enzyme giới hạn, thu được VP1-2A-VP3+.
Tiếp đó, nhóm nghiên cứu bổ sung enzyme BamHI và HindIII, bổ sung enzyme ligaza để tạo ra vectơ pFastBacTMDual mang gen VP1-2A-VP3+ và biến nạp vào tế bào khả biến E.coli JM109, chọn lọc trên môi trường BL có bổ sung 1% kháng sinh ampicillin, sau đó chiết thu được vectơ VP1-2A-VP3+ tái tổ hợp. Nhóm lặp lại quy trình tương tự với gen tái tổ hợp vừa thu được bằng enzyme SmalI và SphI để có được bacmit tái tổ hợp chứa gen VP1-2A-VP3+ và VP0+.
Nhóm tiếp tục tạo baculovirus tái tổ hợp, bổ sung baculovirus tái tổ hợp này vào môi trường nuôi cấy tế bào Sf9 ở nhiệt độ 27oC trong 3 ngày, thu được tế bào Sf9 bị xâm nhiễm. Bước cuối cùng, nhóm “thu tế bào bị xâm nhiễm và xử lý bằng đệm 0,1% triton X-100 trong PBS, 0,5µg aprotinin/ml, 100lg PMSF/ml, 0,5µg leupectin/ml, pH 7,4 lysin để thu nhận hỗn hợp protein” – nhóm phân tích. Sau khi loại cặn bằng cách ly tâm 10.000 vòng/phút trong 20 phút, thu được hạt giả virus gây bệnh lở mồm long móng có khả năng tạo miễn dịch.
Nhóm nghiên cứu cho biết, một trong những yếu tố quan trọng đó là “virus lở mồm long móng có đặc điểm tự sắp xếp thành các hạt khi sao chép trong tế bào nhân thực”, điều này cho phép tạo các hạt giả virus lở mồm long móng trong hệ nuôi cấy tế bào.
Các hạt giả virus này sẽ không gây nhiễm như các virus sống giảm độc lực, đồng thời cũng không sao chép, không gây bệnh như virus bình thường nhưng vẫn có chức năng kích thích miễn dịch. Thêm vào đó, vacxin giả virus không đòi hỏi vật liệu di truyền để tạo hạt giả, nên không có những trở ngại như độc, đột biến ngẫu nhiên, sắp xếp lại tự phát. “Hệ miễn dịch của động vật có vú nhận biết nhanh chóng và tấn công những hạt giả virus này sau khi tiêm phòng. Vì thế cấu tạo của hạt giả virus tương tự như virion truyền nhiễm, chỉ cần lượng nhỏ kháng nguyên VLP đủ để tạo miễn dịch bảo vệ tương tự. Ngoài ra, các hạt giả virus cho thấy kích thích rất hiệu quả sự tăng sinh tế bào CD4+ và đáp ứng tế bào lympho T độc tế bào” – nhóm cho biết.
Với những ưu điểm trên, quy trình tạo hạt giả virus gây bệnh lở mồm long móng nêu trên đã được Cục Sở hữu trí tuệ cấp Bằng giải pháp hữu ích số 2-0002017, được công bố vào ngày 27.05.2019.
Dù vào cuối năm 2018, đã có một công ty nghiên cứu thành công, tự sản xuất vacxin lở mồm long móng trong nước (sản phẩm đã được Cục Thú y cho phép lưu hành), tuy nhiên số lượng sản xuất vẫn rất hạn chế. Cho đến nay, chúng ta vẫn chưa chủ động hoàn toàn được trong vấn đề sản xuất vacxin mà vẫn phải nhập khẩu với một số lượng lớn. Chính vì vậy, quy trình của TS Lê Thị Hồng Minh và các đồng sự có thể sẽ là một lựa chọn khả thi để giúp phát triển một loại vacxin mới, giúp ngành chăn nuôi giải tỏa được tình trạng khan hiếm vacxin như hiện nay.